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離心機(jī)全血基因組提取應(yīng)用

操作步驟（200ul全血）
# 第一次使用前請先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水乙醇!

1. 取200ul新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，放入1.5ml離心管。
對如果全血起始量小于200μl，則用緩沖液BB補(bǔ)足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之間，則后續(xù)操作需要按照比例增加試劑用量。如果起始量介于300μl-1毫升之間，則需要先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解操作（見本說明書后附錄）。

2. 加入200μl 結(jié)合液CB，立刻劇烈顛倒輕搖，充分混勻，再加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，顛倒輕搖充分混勻，70℃放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮（但顏色偏黑色）。

3. 加入100μl 異丙醇，劇烈顛倒輕搖，充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。
上述各操作步驟中適當(dāng)力度充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量，必要時如樣品粘稠不易混勻時可以渦旋振蕩15秒混勻，但不可用手劇烈振蕩，以免剪切DNA。

4. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）10,000 rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。

5. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000 rpm 離心30秒，棄廢液。

6. 加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。

7. 加入500μl漂洗液WB，12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。

8. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

9. 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱）， 室溫放置3-5分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000 rpm離心1分鐘。洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

10. DNA可以存放在2-8℃,如果要長時間存放，可以放置在-20℃。

操作步驟（300ul和 1ml全血）

1. 吸取900μl紅細(xì)胞裂解液（可向本公司購買）到一個1.5ml離心管或者3ml紅細(xì)胞裂解液到一個15ml離心管。

2．將抗凝全血（使用前回復(fù)到室溫）顛倒混勻后，吸取300μl全血和1ml全血分別加到上述1.5ml和15ml離心管中，顛倒6-8次，并倒置輕彈管壁，確保充分混勻。

3．室溫放置10分鐘（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次幫助裂解紅細(xì)胞）。

4．12,000 rpm離心20秒（對于1.5ml離心管），2,000-3,000 rpm離心5分鐘（對于15ml離心管）倒棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細(xì)胞團(tuán)），留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)和大約10μl的殘留上清。離心后在管底應(yīng)該見到白色的白細(xì)胞團(tuán)，也可能有一些紅細(xì)胞殘片和白細(xì)胞團(tuán)在一起，但是如果看到的是大部分的紅色細(xì)胞團(tuán)，說明紅細(xì)胞裂解很不充分，應(yīng)該再加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞團(tuán)后重復(fù)步驟3，4。
5. 加入200μl緩沖液BB渦旋振蕩重懸白細(xì)胞團(tuán)，充分分散白細(xì)胞團(tuán)。其中由于肝素抗凝血的白細(xì)胞沉淀團(tuán)很難打散重懸，影響后續(xù)實驗裂解效果，建議選用非肝素的抗凝劑收集血液標(biāo)本。

6. 現(xiàn)在可以按照操作步驟提取DNA了。

操作步驟（10ml全血）

1．吸取30ml紅細(xì)胞裂解液到一個50ml離心管。

2．將抗凝全血（使用前回復(fù)到室溫）顛倒混勻后，吸取10ml加到上述裝有紅細(xì)胞裂解液離心管中，顛倒6-8次，并倒置輕彈管壁，確保充分混勻。

3．室溫放置10分鐘（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次或者搖床上面輕搖幫助裂解紅細(xì)胞）。

4．2,000 x g離心10分鐘，倒棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細(xì)胞團(tuán)），留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)和大約100μl的殘留上清。離心后在管底應(yīng)該見到白色的白細(xì)胞團(tuán)，也可能有一些紅細(xì)胞殘片和白細(xì)胞團(tuán)在一起，但是如果看到的是大部分的紅色細(xì)胞團(tuán)，說明紅細(xì)胞裂解很不充分，應(yīng)該再加入適量紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞團(tuán)后重復(fù)步驟3，4。

5. 渦旋振蕩15秒重懸白細(xì)胞團(tuán)，充分分散白細(xì)胞團(tuán)。白細(xì)胞的重懸分散對下一步裂解非常重要，白細(xì)胞未打散就加入裂解液，會導(dǎo)致白細(xì)胞不能充分裂解，形成肉眼可見團(tuán)塊。

6． 加入10ml細(xì)胞核裂解液到重懸的白細(xì)胞，迅速有力吹打幾次混勻 以裂解白細(xì)胞，由于基因組DNA立刻釋放出來，這個時候混合物會馬上變得十分粘稠，立刻停止吹打（以免剪切斷基因組DNA），顛倒旋轉(zhuǎn)離心管10次保證裂解液和所有的白細(xì)胞接觸并裂解。這一步對是否獲得滿意的裂解效果和基因組完整性很關(guān)鍵。吹打力量如果太小，不足以迅速將細(xì)胞團(tuán)打散并和裂解液混勻，形成肉眼可見團(tuán)塊無法裂解完全（裂解液如果是和細(xì)胞團(tuán)塊而不是分散的細(xì)胞接觸，立刻會和細(xì)胞團(tuán)塊表面作用后形成粘稠的屏障，不容易再滲透入團(tuán)塊內(nèi)部）。裂解液和細(xì)胞接觸后基因組DNA立刻釋放出來，這個時候吹打力量過大，又易造成基因組斷裂。正確做法，就是迅速有力的吹打幾次，幾秒鐘后基因組釋放出來（變粘稠）立刻停止吹打，或者改用大口徑槍頭（剪去槍頭尖）輕柔吹打或者顛倒混勻。如果還有肉眼可見團(tuán)塊，可在65℃溫育30-60分鐘（不要超過一小時）至裂解完全。

7． 可選步驟：在裂解物中加入RNase A（10mg/ml）至終濃度30μg/ml，顛倒25次混勻，37℃溫育15分鐘去除殘留RNA.然后冷卻回室溫。

8．加入3.33ml蛋白沉淀液后，在渦旋振蕩器上高速連續(xù)振蕩混勻20-25秒。混勻后可能見到一些小的蛋白團(tuán)塊。由于樣品體積重量小，用渦旋振蕩器振蕩混勻產(chǎn)生的剪切力并不會剪切打斷基因組DNA，如果用手振蕩混勻，則不可以用手上下劇烈振蕩混勻，只能適當(dāng)力度振蕩混勻，否則會剪斷基因組DNA，但是力度也不能小,要保證充分混勻，將粘稠的裂解物打散開，否則DNA無法和蛋白質(zhì)沉淀分離開， 離心的時候會和蛋白質(zhì)一起沉淀下來，造成DNA丟失或者降低產(chǎn)量。此外混勻不充分也可能造成蛋白沉淀不充分, 最后的產(chǎn)物污染有較多量的蛋白質(zhì)。因此建議新手還是用渦旋振蕩器混勻。

9．2,000 x g(可根據(jù)離心效果(沉淀如果不緊)調(diào)整加大離心力)離心10分鐘。這時候應(yīng)該可以見到管底暗褐色的蛋白沉淀，也可能見到一些蛋白沉淀漂浮在液體表面。

10．小心吸取上清（大約10ml）到一個新的15ml離心管中。吸取上清時小心不要吸到管底的和漂浮在液體表面的蛋白沉淀，如果不小心將蛋白沉淀轉(zhuǎn)入新的離心管中，可再次離心2分鐘后取上清。

11．加入等體積的室溫異丙醇（約10ml），輕柔顛倒30次混勻或者直到出現(xiàn)棉絮狀（絲狀）白色DNA沉淀。
注意有時候棉絮狀（絲狀）DNA沉淀顛倒混勻的時候，粘附著在蓋子或者管口處，即使顛倒也不跟下來，或者附著有氣泡導(dǎo)致漂浮在液面，這樣導(dǎo)致操作者看不到沉淀，誤認(rèn)為沒有得到DNA。解決辦法是略去步驟12，直接2，000 x g離心1分鐘，棄上清，然后接步驟14。

12．垂直放置離心管，讓白色DNA沉淀自然沉到管底，然后盡可能多的吸棄大部分的上清，注意不要吸到沉淀。

13．加入10ml70％乙醇后，顛倒混勻，2,000 x g離心1-3分鐘，在管底可以見到白色的DNA沉淀塊，倒棄上清。

14．加入3ml70％乙醇，顛倒幾次漂洗DNA沉淀，2,000 x g離心1分鐘, 倒去上清（沉淀很松，注意不要把DNA沉淀倒掉了），倒置后在吸水紙上輕敲幾下以控干殘留乙醇，還可以用槍頭小心吸掉管底沉淀周圍和管壁的殘留乙醇，空氣晾干沉淀幾分鐘。注意不要干燥過頭，否則DNA極其難溶，也不能殘留太多乙醇，否則乙醇可能抑制下游如酶切反應(yīng)。

15．加入600μlDNA（或者根據(jù)濃度需要調(diào)整用量）溶解液重新水化溶解DNA沉淀，輕彈管壁混勻，可以放置在65℃溫育30-60分鐘（不要超過一小時），也可以在室溫或者4℃放置過夜來重新水化DNA，中間不時的輕彈管壁幫助重新水化DNA。

16. DNA可以存放在2-8℃,如果要長時間存放，可以放置在-20℃。